Рекомбинантные аденовирусные частицы что это

Как сделать аденовирусную вакцину?

Введение: Аденовирусы и инфекции

Аденовирусы долгое время используются как инструменты в молекулярной биологии, потому что они способны переносить модифицированную ДНК, они не проявляют склонности интегрировать ДНК в человеческие геномы и умеют заражать как делящиеся, так и неделящиеся клетки. Но, как показывают вышеприведенные цифры, обратная сторона их использования в качестве терапии для людей, состоит в том, что у многих людей с самого начала могут быть антитела для борьбы с вирусным вектором, что, несомненно, снизит эффективность терапии. По этой причине ведется длительный поиск редких и необычных Ad-форм, что объясняет, почему J&J и НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи используют Ad26, Oxford / AZ использует вирус от шимпанзе (а не человеческий), ReiThera использует аденовирус гориллы и т.д. Собственно, поэтому люди задаются вопросом об общей эффективности CanSino, поскольку они используют Ad5 подтип.

Создание аденовирусного вектора

Очистка и упаковка

Выделение вирусных частиц, вероятно, устроена очень похожим образом во всех обсуждаемых вакцинах. Мне не удалось (что неудивительно) найти подробную информацию о производстве какой-либо из текущих вакцин, но, вероятно, этот этап был одним из менее сложных частей оптимизации процесса, учитывая всю работу, которая уже была проделана над аденовирусами в течение многих лет. Вы лизируете клетки культур и делаете грубую фильтрацию, чтобы пропустить вирусные частицы и удержать клеточный мусор. Согласно этой странице от AstraZeneca, похоже, что они применяют несколько этапов фильтрации, а затем используют мембранную хроматографию (вероятно, используют какой-то варианта ионообменной технологии, разделения по заряженным остаткам поверхностных белков вируса) с последующей ультрафильтрацией. Можно поспорить, что все обсуждаемые компании уже имели довольно четкое представление о том, какие именно шаги они собираются предпринять, даже если все шаги требовали некоторой настройки оптимизаций, а также верификации на каждом шаге. Соответствующие регуляторы, знают обо всех деталях, но я не думаю, что мы увидим подробности.

подробнее про то, где производятся и упаковываются аденовирусные вакцины

Я заметил, что самые ранние партии вакцины от Oxford/AZ были произведены в самом Оксфорде, а позже были произведены и упакованы компанией Advent (в Помезии, Италия) и COBRA Biologics (в Килле, Великобритания) с заправкой флаконов. от Symbiosis (в Стерлинге, Великобритания). Они работают с крупной контрактной фирмой Catalent как в США (Харманс, штат Мэриленд), так и в Европе (Ананьи, Италия) в области разлива/финализации. Также есть производство в в Нидерландах (Halix) и Бельгии (Novasep, в Seneffe). В последней фабрике, по-видимому, и наблюдались проблемы с выходом вакцины. Он также финализируется в Дессау, Германия, компанией IDT Biologika. Русский производитель R-Pharm имеет завод в Германии, производящий на экспорт в страны СНГ (там же производится вакцина НИЦЭМ им. Н. Ф. Гамалеи). Испанский Insud также задействован, как и их новый завод в Аргентине. AZ также имеет крупное производственное соглашение с Сывороточным институтом Индии, а WuXi участвует в Китае и на заводе в Вуппертале, Германия. Я уверен, что пропустил несколько сделок.

J&J, со своей стороны, имеет большие мощности в Нидерландах (например, в Лейдене), а также они подписали соглашения с Emergent на производство вакцины в Балтиморе (которые также работают с AstraZeneca и, с Novavax, которая делает пептидную вакцину на отдельном заводе в Мэриленде). Они также работают с Catalent (на их заводе в Блумингтоне, Индиана, а также на заводе Ананьи, в Италии), Reig Jofre в Барселоне, Aspen Pharmacare (в Порт-Элизабет, Южная Африка), Biological E в Индии (которые только что купили еще один завод в Химачал-Прадеше), а также с PCI Pharma для хранения и транспортировки. Без сомнения, есть и другие сделки.

Итак, теперь вы знаете про весь процесс, по крайней мере в общих чертах. Любой из этапов можно рассматривать детальнее, но по большей части текст должен дать вам базовое представление о том, что происходит (а во многих случаях, дает вам даже больше, чем вы когда-либо хотели знать!). Как видите, это принципиально иной процесс, нежели производство вакцины мРНК, со своей спецификой (хорошей и плохой). Все это может стать важным, если нам придется переоборудовать существующие вакцины-кандидаты для новых вариантов, но это тема для другого дня!

В предыдущей публикации о мРНК вакцинах, Дерек писал чуть более структурированно, но в этой статье, к сожалению, текст разделен еще меньше. Если еще дальше уходить от деталей, то этапы, приблизительно, можно разделить таким образом:

создание вирусной ДНК (обычно в бактериях)

лизис бактерий, раскрытие циклической ДНК в линейную

внедрение линейных ДНК в культуру человеческих клеток (вероятно самый сложный и капризный этап)

Источник

Рекомбинантные аденовирусные частицы что это

ФГБУН Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия, 119334

ФГБУН Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия, 119334

Оптимизированный метод получения рекомбинантных аденовирусных плазмид без использования электропорации

Журнал: Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4): 186-191

Шепелев М. В., Коробко И. В. Оптимизированный метод получения рекомбинантных аденовирусных плазмид без использования электропорации. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2019;37(4):186-191.
Shepelev M V, Korobko I V. Optimized electroporation-free method for generation of recombinant adenoviral plasmids. Molecular Genetics, Microbiology and Virology. 2019;37(4):186-191.
https://doi.org/10.17116/molgen201937041186

ФГБУН Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия, 119334

Рекомбинантные аденовирусы широко используются для доставки и экспрессии трансгенов как для терапевтических целей, так и в фундаментальных исследованиях. Система аденовирусных векторов AdEasy позволяет быстро и эффективно создавать рекомбинантные репликативно-дефицитные аденовирусы. Получение рекомбинантной аденовирусной плазмиды за счет гомологичной рекомбинации в клетках E. coli BJ5183 между шаттл-вектором, кодирующим трансген, и плазмидой pAdEasy-1, несущей большую часть генома аденовируса человека серотипа 5 (Ad5), является одним из важнейших этапов при создании рекомбинантных аденовирусов. Во многих опубликованных протоколах указывается на необходимость трансформации шаттл-вектора и плазмиды pAdEasy-1 в клетки E. coli путем электропорации, что требует наличия соответствующего оборудования и расходных материалов. В данной работе нами был предложен оптимизированный протокол получения рекомбинантных аденовирусных плазмид с использованием только химически компетентных клеток E. coli, без применения электропорации. Показана эффективная трансформация неочищенного линеаризованного шаттл-вектора в химически компетентные клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1, позволяющая идентифицировать клоны с корректными рекомбинантными аденовирусными плазмидами. С использованием оптимизированного протокола были получены четыре функциональных репликативно-дефицитных аденовируса, экспрессирующих целевые белки в клетках HEK293. Предложенный протокол позволяет существенно упростить и удешевить методологию получения рекомбинантных аденовирусов, так как отпадает необходимость использования оборудования и расходных материалов для электропорации.

ФГБУН Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия, 119334

ФГБУН Институт биологии гена Российской академии наук, Москва, Россия, 119334

В настоящее время аденовирусы широко применяются для доставки и экспрессии трансгенов для терапевтических целей и в фундаментальных исследованиях [1]. Система аденовирусных векторов AdEasy TM является одной из наиболее часто используемых для быстрого и эффективного создания рекомбинантных репликативно-дефицитных аденовирусов. В системе AdEasy рекомбинантная аденовирусная плазмида создается посредствам гомологичной рекомбинации в клетках E. coli BJ5183 между шаттл-вектором, кодирующим ген интереса, и плазмидой pAdEasy-1, несущей большую часть генома аденовируса человека серотипа 5 (Ad5). Далее полученная рекомбинантная аденовирусная плазмида трансфицируется в упаковочную клеточную линию (например, HEK293), в которой происходит сборка вирусных частиц и репликация вируса [2, 3].

Создание рекомбинантной аденовирусной плазмиды является одним из важнейших этапов получения рекомбинантных аденовирусов. В исходном варианте системы AdEasy в клетки штамма BJ5183 котрансформируют шаттл-вектор и плазмиду pAdEasy-1, отбирая канамицин-устойчивых рекомбинантов [2]. Повысить эффективность получения рекомбинантной аденовирусной плазмиды можно за счет создания штамма клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1, который получают путем трансформации клеток BJ5183 плазмидой pAdEasy-1. Далее в клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 трансформируют шаттл-вектор, что существенно увеличивает эффективность гомологичной рекомбинации по сравнению с котрансформацией двух плазмид в штамм BJ5183 [4].

Согласно приведенным выше протоколам [2, 4], для получения рекомбинантной аденовирусной плазмиды в системе AdEasy необходимо проведение электропорации плазмидной ДНК, что требует наличия дорогостоящего оборудования и расходников (кюветы), а также приготовления в лаборатории или приобретения высокоэффективных электрокомпетентных клеток E. coli. Однако в ряде работ для получения рекомбинатной аденовирусной плазмиды использовали химически компетентные клетки E. coli [5, 6].

Задачей данной работы была оптимизация протокола получения рекомбинатной аденовирусной плазмиды в системе AdEasy с использованием химически компетентных клеток, приготовленных в лабораторных условиях по одной из самых простых методик. В результате с использованием химически компетентных клеток нами были успешно созданы рекомбинантные аденовирусные плазмиды и получены репликативно-дефицитные аденовирусы, экспрессирующие целевые белки. Описанный нами протокол позволяет быстро и эффективно получать рекомбинантные аденовирусные плазмиды с помощью системы AdEasy без проведения электропорации, а также без дополнительной очистки линеаризованного шаттл-вектора.

Материал и методы

Плазмиды. Плазмиды pShuttle-CMV и pAdEasy-1 были приобретены у компании «Agilent Technologies» (США). Для создания шаттл-векторов, кодирующих кДНК слитого белка Egfp-Pdcd4 с мутациями в кДНК Pdcd4 RBM12 S457A или RBM12 D235A D418A, NheI (обработан фрагментом Кленова) — SalI фрагменты кДНК клонировали из соответствующих векторов pEgfp-C2-Pdcd4 RBM12 S457A или pEgfp-C2-Pdcd4 RBM12 D235A D418A в вектор pShuttle-CMV по сайтам BglII (обработан фрагментом Кленова) и SalI. Мутантная форма Pdcd4 RBM12, несущая аминокислотные замены K60A, R61A, R62A, R64A, K65A, R102A и R103A, была описана ранее [7]. Точечные мутации вводили с помощью сайт-направленного мутагенеза с помощью метода с двумя комплементарными олигонуклеотидными праймерами на основе протокола QuikСhange Site-Directed Mutagenesis kit («Agilent Technologies»). В качестве матрицы в ПЦР использовали плазмиду pCR-Blunt («Invitrogen», США), несущую кДНК белка Pdcd4 человека, фланкированную сайтами рестрикции EcoRI-SalI. ПЦР проводили с использованием ДНК полимеразы AccuPrime Pfx («Invitrogen») в реакции объемом 50 мкл, включавшей 1-кратный реакционный буфер, 300 нМ прямого и обратного праймеров, 100 нг плазмидной матрицы и 2,5 ед. ДНК-полимеразы при следующих условиях: 94 °C — 3 мин (94 °С — 40 с, 55 °C — 1 мин, 68 °C — 5 мин) — 15 циклов, 68 °C — 3 мин. Продукт ПЦР обрабатывали рестриктазой DpnI в течение 2 ч для расщепления плазмидной матрицы и трансформировали 10 мкл в химически компетентные клетки E. coli XL-1 Blue MRF’. Мутации в различных участках кДНК Pdcd4 вводили последовательно. Далее кДНК белка Pdcd4 с нужными мутациями субклонировали в вектор pEGFP-C2 («Clontech», США) по сайтам EcoRI-SalI. Для мутагенеза использовали следующие олигонуклеотидные праймеры: S457A (5`-gcagaaagcgttttgtagccgaaggagatggaggtc-3` и 5`-gacctccatctccttcggctacaaaacgctttctgc-3`); D235A (5’-gggacagtaatgagcacaactgctgtggaaaaatcatttgataaa-3’ и 5’-tttatcaaatgatttttccacagcagttgtgctcattactgtccc-3’); D418A (5’-ttccggacattaatctggctgtcccacattcatactc-3’ и 5’-gagtatgaatgtgggacagccagattaatgtccggaa-3’); K60A, R61A, R62A, R64A, K65A (5’-atcgcctctgccagagtcccgggatgagtttgccgctagtgccgctgctgccttggcattaattctagcttcgttaatg-3’ и 5’-cattaacgaagctagaattaatgccaaggcagcagcggcactagcggcaaactcatcccgggactctggcagaggcgat-3’); R102A, R103A (5’-caaagggaaggttgctggatgcggcatccagatctgggaaagg-3’ и 5’-cctttcccagatctggatgccgcatccagcaaccttccctttg-3’). Для создания шаттл-вектора, кодирующего внутриклеточный домен белка Notch1 крысы (аминокислотные остатки 1749 — 2531) c c-myc эпитопом на C-конце (NICD-myc), EcoRI (обработан фрагментом Кленова) — NotI фрагмент кДНК NICD-myc клонировали из вектора pEgfp-N2-NICD-myc в вектор pShuttle-CMV по сайтам BglII (обработан фрагментом Кленова) и NotI. Вектор для продукции белков с C-концевым c-myc эпитопом (pEGFP-N2-myc) создавали на основе вектора pEGFP-N2 («Clontech») путем клонирования по сайтам BamHI-NotI двухцепочечных олигонуклеотидов, полученных путем гибридизации одноцепочечных олигонуклеотидов, кодирующих аминокислотную последовательность c-myc эпитопа (5`-gatccgtcgacgagcagaagctgatctccgaggaggacctgtaagc-3` и 5`-ggccgcttacaggtcctcctcggagatcagcttctgctcgtcgacg-3`). кДНК NICD амплифицировали в ПЦР с праймерами 5`-gaattcgccaccatgaagcgcaggcggcagcat-3` и 5`-gtcgaccttaaatgcctctggaatg-3` и клонировали в вектор pEGFP-N2-myc по сайтам EcoRI-SalI, получая вектор pEgfp-N2-NICD-myc. Для создания шаттл-вектора, кодирующего протеинкиназу Pak5 человека, слитую с Egfp, NheI (обработан фрагментом Кленова) — SmaI фрагмент кДНК Egfp-Pak5 клонировали из вектора pEgfp-C1-Pak5, описанного ранее [8], в вектор pShuttle-CMV по сайту BglII (обработан фрагментом Кленова). Для генно-инженерных манипуляций с плазмидами и получения плазмидной ДНК в препаративных количествах использовали штамм E. coli XL-1 Blue MRF’ («Stratagene», США). Выделение плазмидной ДНК из клеток E. coli проводили с использованием набора GenElute Plasmid MiniPrep Kit («Sigma», США) в соответствии с протоколом производителя. Нуклеотидные последовательности всех амплифицированных в ПЦР кДНК верифицировали путем секвенирования ДНК с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3730 DNA Analyzer в ЦКП «Геном» Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, Россия.

Культивирование клеток E. coli. Клетки E. coli культивировали в жидкой среде Miller’s LB broth (0,171 М NaCl, 1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт) («BD Bioscience», США) при +37 °С. Для заливки чашек Петри к среде LB добавляли бактериальный агар («BD Bioscience») до концентрации 1.5%. Клетки штамма E. coli BJ5183 («Agilent Technologies») культивировали в присутствии 30 мкг/мл стрептомицина, клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 — в присутствии 30 мкг/мл стрептомицина и 50 мкг/мл ампициллина, клетки штамма E. coli XL-1 Blue MRF’ — в присутствии 12,5 мкг/мл тетрациклина. В работе использовали следующие реагенты: ампициллин натрия (ОАО «Синтез», Россия), канамицин сульфат (ОАО «Биохимик», Россия), тетрациклин гидрохлорид («Sigma», США), стрептомицин (ОАО «Биохимик»).

Приготовление и трансформация химически компетентных клеток E. coli. Химически компетентные клетки штаммов E. coli BJ5183, E. coli BJ5183-pAdEasy-1 и E. coli XL-1 Blue MRF’ готовили в соответствии с протоколом, описанным в [9]. В частности, клетки соответствующих штаммов высевали на селективную чашку и растили в течение ночи. На следующий день инокулировали 10 мл ночной культуры среды LB без антибиотиков и растили в течение ночи. С утра переносили 2 мл ночной культуры в 200 мл среды LB без антибиотиков и растили в течение 3—4 ч до достижения оптической плотности 0,45—0,55 при длине волны 600 нм. Клетки охлаждали на льду в течение 2 ч и центрифугировали при 2500 g в течение 15 мин при +4 °С. Осадок ресуcпендировали в ледяном буфере (40 мМ натрия ацетат pH=5,5, 100 мМ CaCl₂, 70 мМ MgCl₂) и инкубировали на льду в течение 45 мин. Далее клетки осаждали центрифугированием при 1800 g в течение 10 мин при +4 °С, осадок ресуспендировали в буфере (40 мМ натрия ацетат pH=5,5, 100 мМ CaCl₂, 70 мМ MgCl₂, 15% глицерин), суспензию клеток разливали в аликвоты по 100 мкл, замораживали в жидком азоте и хранили при –80,°С. Трансформацию химически компетентных клеток E. coli проводили, как описано в [9]. В частности, к аликвоте компетентных клеток добавляли 3 мкл диметилсульфоксида, перемешивали, добавляли плазмидную ДНК, перемешивали и инкубировали на льду в течение 30 мин. Для проведения теплового шока клетки помещали на 50 с в водяную баню (+42 °С), потом быстро переносили в лед и инкубировали на льду 1 мин. Далее суспензию клеток переносили в 1 мл среды LB без антибиотиков и инкубировали клетки при интенсивном перемешивании при +37 °С в течение 1 ч, после чего клетки осаждали центрифугированием (30 с, 16 000 g), отбирали часть супернатанта и высевали клетки на предварительно прогретые до +37 °С чашки с LB агаром, содержавшим соответствующие антибиотики.

Культуры клеток. Клетки линии HEK293 (European Collection of Cell Cultures, #85120602) культивировали в среде DMEM («HyClone», США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки («HyClone»), 100 ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина («Gibco», США). Для трансфекции клеток линеаризованной рекомбинантной аденовирусной плазмидой использовали реагент EcoTransfect («OZ Bioscience», Франция).

Получение рекомбинантных аденовирусов. Рекомбинантные аденовирусные плазмиды, выделенные из клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1, трансформировали в клетки E. coli XL-1 Blue MRF’ и выделяли плазмиды в препаративных количествах. Далее, начиная с этапа линеаризации рекомбинантной аденовирусной плазмиды и трансфекции упаковочной клеточной линии HEK293, аденовирусы получали в соответствии с опубликованным протоколом [3]. В частности, 5 мкг рекомбинантной аденовирусной плазмиды линеаризовали с использованием 5 ед. эндонуклеазы рестрикции PacI («ThermoFisher Scientific», #ER1342) в течение 3 ч в реакции объемом 100 мкл при +37 °С, после чего добавляли 10 мкл 3 М ацетата натрия pH=5,2 и 275 мкл этанола, перемешивали, инкубировали 20 мин при –20 °С, центрифугировали 10 мин при 14 000 g, промывали осадок два раза 70% этанолом, ресуспендировали в 40 мкл стерильной воды и использовали для трансфекции. Далее клетки линии HEK293 рассевали в количестве 1,4·10 6 клеток на 60-мм культуральную чашку и на следующий день трансфицировали, используя 4 мкг линеаризованной рекомбинантной аденовирусной плазмиды. Клетки культивировали в течение 15 (аденовирус NICD-myc), 17 (Egfp-Pdcd4) или 22 дней (Egfp-Pak5), каждые 2—3 дня добавляя к клеткам по 1 мл свежей среды. Далее собирали первичный вирусный сток, для выхода вируса клетки разрушали за счет двух циклов замораживания-оттаивания, после чего проводили три раунда амплификации аденовирусов и инфицирование клеток линии HEK293 вирусным стоком с предыдущего этапа (1 раунд: 3·10 6 клеток на 60-мм культуральной чашке; 2 раунд: 7·10 6 клеток на 100-мм культуральной чашке; 3 раунд: 7·10 6 клеток на пяти 100-мм культуральных чашках). После последнего раунда амплификации аденовирус разливали в аликвоты и хранили при –70 °С.

Вестерн-блот анализ. Вестерн-блот анализ образцов проводили, как описано в [10], с использованием следующих антител: мышиные моноклональные к c-myc эпитопу, клон 9E10 («Sigma», #M5546, разведение 1:2000); мышиные моноклональные к α-тубулину, клон DM1α, («Sigma», #T9026, разведение 1:5000), мышиные моноклональные к Egfp, клон 3A9, («Протеинсинтез», Россия #PSM001, разведение 1:2000).

Результаты и обсуждение

В опубликованных протоколах создания рекомбинантных аденовирусов на основе системы AdEasy для трансформации клеток E. coli штаммов BJ5183 или E. coli BJ5183-pAdEasy-1 используется электропорация плазмидной ДНК, что обеспечивает высокую эффективность трансформации, до 1·10 7 КОЕ/мкг плазмидной ДНК при использовании коммерчески доступных электрокомпетентных клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1 [2—4]. В ряде других работ сообщалось об использовании химически компетентных клеток штамма E. coli BJ5183 для получения рекомбинантных аденовирусных плазмид путем котрансформации линеаризованных шаттл-вектора и аденовирусной плазмиды [5, 6], без использования штамма, аналогичного штамму E. coli BJ5183-pAdEasy-1 [4]. При этом проводили очистку шаттл-вектора из агарозного геля и переосаждение линеаризованной аденовирусной плазмиды перед котрансформацией [6] или оптимизацию соотношения количества шаттл-вектора и аденовирусной плазмиды [5]. Мы предположили, что протокол получения рекомбинантных аденовирусных плазмид можно оптимизировать и упростить за счет использования химически компетентных клеток E. coli, приготовленных по одной из простейших методик, создания клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 для повышения эффективности гомологичной рекомбинации и отказа от очистки линеаризованного шаттл-вектора из агарозного геля перед трансформацией.

Сначала готовили химически компетентные клетки E. coli BJ5183 и трансформировали их плазмидой pAdEasy-1. Эффективность трансформации химически компетентных клеток E. coli BJ5183 составляла 3·10 5 КОЕ/мкг плазмидной ДНК при использовании плазмиды pAdEasy-1 (33.4 т.п.н.). Обычно подобная эффективность считается недостаточной для использования компетентных клеток для генно-инженерных манипуляций, однако при трансформации очищенной плазмидной ДНК, и, учитывая большой размер плазмиды pAdEasy-1, подобная эффективность трансформации позволяет получить достаточное количество колоний на чашке для дальнейшего отбора и анализа корректных клонов. Далее, из нескольких колоний выделяли плазмиду pAdEasy-1 и анализировали ее с помощью эндонуклеаз рестрикции BglII и HindIII. Клетки одного из клонов с корректным паттерном рестрикции плазмиды pAdEasy-1 (данные не показаны) использовали для приготовления глицеринового стока клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 и далее готовили химически компетентные клетки штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1.

Для получения рекомбинантных аденовирусных плазмид были созданы четыре шаттл-вектора, кодирующие слитые белки Egfp-Pdcd4 RBM12 S457A, Egfp-Pdcd4 RBM12 D235A D418A, Egfp-Pak5 и NICD-myc. В ряде протоколов, включая протокол для коммерчески доступной системы AdEasy от компании «Agilent Technologies» («AdEasy XL Adenoviral Vector System Instruction Manual», Revision C1), указывается на необходимость очистки из агарозного геля шаттл-вектора после линеаризации [5, 6]. Однако было показано использование неочищенного линеаризованного шаттл-вектора для электропорации клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 [4]. Мы решили использовать для трансформации химически компетентных клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1 неочищенный шаттл-вектор, обработанный фосфатазой для минимизации рециркуляризации шаттл-вектора в клетках E. coli. 1 мкг соответствующих шаттл-векторов линеаризовали с использованием 5 ед. эндонуклеазы рестрикции MssI («ThermoFisher Scientific», #ER1342) в течение 2 ч в реакции объемом 50 мкл при +37 °С, после чего добавляли 1 ед. щелочной фосфатазы CIAP («Fermentas», #EF0341) и инкубировали еще 30 мин при +37 °С. Затем 5 мкл рестрикционной смеси (эквивалентно 100 нг плазмидной ДНК) трансформировали в химически компетентные клетки E. coli BJ5183-pAdEasy-1 и отбирали трансформантов на чашках, содержащих 50 мкг/мл канамицина. В результате трансформации на чашках ожидается формирование колоний двух типов: больших, выросших из клеток, трансформированных недорезанным или восстановленным в результате лигирования в клетках E. coli шаттл-вектором, и маленьких, вырастающих из клеток, в которых произошла рекомбинация между шаттл-вектором и плазмидой pAdEasy-1. Для оценки эффективности гомологичной рекомбинации в клетках штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 при использовании предложенного нами протокола был проведен подсчет колоний двух типов. При этом было установлено, что при проведении реакций трансформации с использованием четырех созданных нами шаттл-векторов на чашках выросло в среднем 144±31 большая колония и 89±27 маленьких колоний. По 10 маленьких колоний с каждой из чашек были проанализированы на предмет наличия корректной рекомбинантной аденовирусной плазмиды с помощью анализа электрофоретической подвижности суперскрученной плазмидной ДНК (рис. 1, а) Рис. 1. Электрофоретический анализ потенциальных рекомбинантных аденовирусных плазмид, выделенных из клеток BJ5183-pAdEasy-1 после трансформации шаттл-вектором. Показаны результаты гель-электрофореза в 0,9% ТАЕ-агарозном геле суперскрученной (а) и обработанной эндонуклеазой рестрикции PacI (б) плазмидной ДНК, выделенной из маленьких канамицин-резистентных колоний (дорожки 1—10 на панелях, а и б, на каждую дорожку нанесено 140—200 нг плазмидной ДНК). Панель а: дорожка 11 — плазмида pAdEasy-1 (250 нг), дорожка 12 — вектор pShuttle-CMV-Egfp-Pdcd4 RBM12 S457A (250 нг). Положение фрагментов ДНК размером 3 и 4.5 т.п.н. указано стрелками. Слева указаны размеры фрагментов ДНК-маркера O’GeneRuler 1kb DNA Ladder («Thermo Fisher Scientific», США) (в т.п.н.). и с помощью эндонуклеазы рестрикции PacI (см. рис. 1, б). Как видно из рис. 1, а, 9 из 10 проанализированных клонов (кроме клона #7) с одной из чашек содержали рекомбинантную аденовирусную плазмиду. Анализ с помощью рестриктазы PacI выявил корректный паттерн рестрикции (наличие вырезаемых фрагментов ДНК размером 3 или 4.5 т.п.н.) для семи из девяти обнаруженных рекомбинантных плазмид (кроме клонов #2 и #4). Также был выявлен корректный паттерн рестрикции при анализе с помощью рестриктазы HindIII (данные не показаны).

Таким образом, нами было установлено, что эффективность трансформации химически компетентных клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1 неочищенным линеаризованным шаттл-вектором позволяет получить число маленьких колоний (890±270 в пересчете на 1 мкг линеаризованного шаттл-вектора), достаточное для идентификации корректной рекомбинантной аденовирусной плазмиды. Более того, нами было установлено, что химически компетентные клетки E. coli BJ5183-pAdEasy-1 после года хранения при –80 °С сохраняют эффективность трансформации, достаточную для идентификации клонов, содержащих аденовирусную плазмиду с корректной рекомбинацией (данные не показаны).

Далее для проверки функциональности рекомбинантных плазмид получали аденовирусы в соответствии с опубликованным протоколом [3]. Проводили 3 раунда амплификации вирусных стоков, после чего инфицировали клетки HEK293 для проверки продукции соответствующих белков. На рис. 2 показаны Рис. 2. Вестерн-блот анализ лизатов клеток линии HEK293, инфицированных рекомбинантными аденовирусами. Клетки HEK293 рассевали в количестве 1·10 5 в лунку 24-луночного планшета, на следующий день инфицировали аденовирусами, через 48 ч после инфекции получали клеточные лизаты и проводили Вестерн-блот анализ с использованием указанных антител. Клетки инфицировали аденовирусами для продукции белков (а) NICD-myc (дорожка 2), (б) Egfp-Pak5 (дорожка 2) и (в) Egfp-Pdcd4 RBM12 S457A и Egfp-Pdcd4 RBM12 D235A D418A, дорожки 2 и 3 соответственно. Дорожка 1 во всех панелях — неинфицированные клетки. результаты вестерн-блот анализа лизатов клеток, инфицированных стоками аденовирусов для продукции белков Egfp-Pdcd4 RBM12 S457A, Egfp-Pdcd4 RBM12 D235A D418A, Egfp-Pak5 и NICD-myc. Как видно, все полученные аденовирусы экспрессируют кодируемые шаттл-векторами кДНК.

Таким образом, нами был предложен оптимизированный протокол получения рекомбинантных аденовирусных плазмид на основе системы AdEasy, который не требует проведения электропорации и очистки линеаризованного шаттл-вектора. Нами было продемонстрировано эффективное получение рекомбинантных аденовирусных плазмид в результате трансформации химически компетентных клеток штамма E. coli BJ5183-pAdEasy-1, приготовленных в лаборатории с помощью простой и доступной методики. Химически компетентные клетки E. coli BJ5183-pAdEasy-1 сохраняют высокую эффективность трансформации на протяжении как минимум одного года, что позволяет быстро и эффективно создавать рекомбинантные аденовирусные плазмиды, используя единожды приготовленный запас компетентных клеток. Предложенный нами оптимизированный метод получения рекомбинантных адено-вирусных плазмид основан на использовании химически компетентных клеток, создание которых доступно для практически любой молекулярно-биологической лаборатории и не требует дорогостоящих реактивов, специальных навыков или оборудования. Кроме того, показанная нами эффективность трансформации компетентных клеток E. coli BJ5183-pAdEasy-1, в отличие от ранее опубликованных протоколов [3, 5, 6], позволяет отказаться от проведения очистки из геля или переосаждения линеаризованного шаттл-вектора, что также существенно упрощает процедуру получения рекомбинантных плазмид. Оптимизированный нами про-токол подтверждает возможность отказа от проведения электропорации, что делает создание рекомбинантных аденовирусов более доступным для широкого круга пользователей за счет отсутствия необходимости использования оборудования и расходных материалов для электропорации или приобретения высокоэффективных электрокомпетентных клеток. Валидность предложенного нами подхода была подтверждена успешным получением функциональных аденовирусов, экспрессирующих соответствующие рекомбинантные белки в клетках HEK293.

В работе была использована инфраструктура Центра коллективного пользования Института биологии гена Российской академии наук «Биология живой клетки и биомедицинские нанотранспортеры лекарств».

Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты № 16−04−00686 и № 16−04−00376).

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.

Источник